1、通過細(xì)胞色素C的制備，了解制備蛋白質(zhì)制品的一般原理和步驟

　　2、掌握制備細(xì)胞色素C的操作技術(shù)及含量的測定方法

　　實(shí)驗(yàn)原理：

　　細(xì)胞色素是一類含有鐵啉基團(tuán)的電子傳遞蛋白，只存在于需氧細(xì)胞中。細(xì)胞色素在線粒體內(nèi)膜上起傳遞電子的作用。細(xì)胞色素C是細(xì)胞色素一種。它在線粒體呼吸鏈上位于細(xì)胞色素B和細(xì)胞色素氧化酶之間，是呼吸鏈的一個重要組成部分。每分子細(xì)胞色素C含有一個血紅素和一條多肽鏈。現(xiàn)已從許多來源獲得細(xì)胞色素C結(jié)晶，并已對100多種細(xì)胞色素C蛋白的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測定。

　　結(jié)果表明，細(xì)胞色素C的氨基酸殘基的數(shù)目在103~113之間；不同來源細(xì)胞色素C的的氨基酸殘基的順序及含量都有一定的差異。細(xì)胞色素C中賴氨酸含量較高，等電點(diǎn)為10.7，含鐵量為0.38%~0.43%，Mr為12000~13000，豬心細(xì)胞色素C分子量12200。細(xì)胞色素C是一種穩(wěn)定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性水提取。

　　細(xì)胞色素C分為氧化型和還原型兩種，氧化型水溶液呈深紅色，還原型水溶液呈桃紅色。細(xì)胞色素C對熱比較穩(wěn)定，不易變性。pH 7.2~10.2，100℃加熱3分鐘，細(xì)胞色素C氧化型和還原型變性程度均為18%~28%，若增加加熱時間，氧化型的不可逆變性程度比還原型的為高。細(xì)胞色素C對酸堿也較穩(wěn)定，可抵抗0 .3mol/L氫氧化鉀溶液的長時間處理。一般都將細(xì)胞色素C制成還原型的，因?yàn)楸容^穩(wěn)定并易于保存。

　　細(xì)胞色素C 是以一種鐵卟啉為輔基的呼吸酶，廣泛存在于所有的需氧組織中。在心肌與其他做劇烈運(yùn)動的肌肉中含量zui為豐富。細(xì)胞色素C 位于線粒體的蛋白質(zhì)—脂質(zhì)絡(luò)合物中，分子量約為13000，肽鏈中含有19個賴氨酸殘基，為一堿性蛋白, 等電點(diǎn)（10.5~10.8）高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石為鋁酸鈉，它是一種陽離子交換劑，細(xì)胞色素C 分子剛好進(jìn)入它的表面空隙。在pH7.5時細(xì)胞色素C 呈正電荷，它可與沸石分子上的鈉離子發(fā)生交換，從而被沸石吸附。裝入層析柱后，用25%硫酸銨洗脫，又可將細(xì)胞色素C 交換下來。硫酸銨主要是降低沸石對細(xì)胞色素C 的親和力。硫酸銨鹽析可明顯提高細(xì)胞色素C 純度，主要為去除雜蛋白。另外乙酸可引起細(xì)胞色素C 變性和聚合，必須嚴(yán)格控制酸用量。

　　細(xì)胞色素C與材料試劑

　　1、 設(shè)備：組織搗碎機(jī)、酸度計、離心機(jī)、分光光度計、層析柱、透析袋、磁力攪拌器、冰箱。

　　2、 儀器：剪刀、燒杯、漏斗、濾紙、天平、玻璃棒、紗布、試管、膠頭滴管。

　　3、 試劑：聯(lián)二亞硫酸鈉、硫酸、硫酸銨、、人造沸石、氫氧化銨。

　　4、 材料：新鮮豬心（2個）。

　　結(jié)果表明，細(xì)胞色素C的氨基酸殘基的數(shù)目在103~113之間；不同來源細(xì)胞色素C的的氨基酸殘基的順序及含量都有一定的差異。細(xì)胞色素C中賴氨酸含量較高，等電點(diǎn)為10.7，含鐵量為0.38%~0.43%，Mr為12000~13000，豬心細(xì)胞色素C分子量12200。細(xì)胞色素C是一種穩(wěn)定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性水提取。細(xì)胞色素C分為氧化型和還原型兩種，氧化型水溶液呈深紅色，還原型水溶液呈桃紅色。細(xì)胞色素C對熱比較穩(wěn)定，不易變性。pH 7.2~10.2, 100℃加熱3分鐘，細(xì)胞色素C氧化型和還原型變性程度均為18%~28%，若增加加熱時間，氧化型的不可逆變性程度比還原型的為高。細(xì)胞色素C對酸堿也較穩(wěn)定，可抵抗0 .3mol/L氫氧化鉀溶液的長時間處理。一般都將細(xì)胞色素C制成還原型的，因?yàn)楸容^穩(wěn)定并易于保存。

　　細(xì)胞色素C不是根據(jù)輔基來命名；與其他三類細(xì)胞色素非共價結(jié)合血紅素不同的是，細(xì)胞色素c通過分子中的半胱氨酸巰基與血紅素共價結(jié)合。細(xì)胞色素e尚無，但有細(xì)胞色素f（細(xì)胞色素c中的一種）。[3]此外，細(xì)胞色素d僅存在于細(xì)菌中。

　　在線粒體和葉綠體中，細(xì)胞色素常常結(jié)合在電子傳遞和相關(guān)代謝途徑的復(fù)合物酶中。

　　細(xì)胞色素C過敏試驗(yàn)

　　細(xì)胞色素C是一種輔酶，在生物氧化過程中起著傳遞電子的作用，改善缺氧時的細(xì)胞呼吸，促進(jìn)物質(zhì)代謝，臨床多用做能量合劑的配方。應(yīng)用時要警惕過敏反應(yīng)。為防止過敏反應(yīng)，在用藥前應(yīng)先作過敏試驗(yàn)。

　　一、皮試液的配制

　　取細(xì)胞色素C（每支2ml含15mg）0.1ml加等滲鹽水至1ml，每ml含 0.75mg 。

　　二、試驗(yàn)方法

　?。ㄒ唬?皮內(nèi)試驗(yàn) 取細(xì)胞色素C試驗(yàn)液 0.1ml(含0.075mg),作皮內(nèi)注射，觀察20分鐘后，判斷試驗(yàn)結(jié)果。

　?。ǘ﹦澓墼囼?yàn) 取細(xì)胞色素C原液（每ml含2.5mg）1滴，滴于前臂內(nèi)側(cè)皮膚上作劃痕法（以無菌針頭透過藥液，劃刺皮膚兩道，長約5mm，其深度以不出血為宜。即劃破皮不出血。）觀察20分鐘后判斷試驗(yàn)結(jié)果。

　　三、試驗(yàn)結(jié)果判斷

　　局部發(fā)紅，直徑大于1cm，有丘疹者陽性。